1. 样本制备：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌环境下截取出近胃端处3-15 cm肠组织，用镊子小心去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含1%双抗（60162ES）的DPBS（60154ES）溶液中。

2. 样本清洗：使用注射器冲洗肠道2-3次，用手术剪将肠管小心剪开，肠腔面朝上，手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后（呈现组织透明），将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗2-3次。

3. 样本初处理：将清洗后的小肠组织剪碎至2 mm宽大小块状体，顺势转移至新的50 mL离心管（83508ES）中，用DPBS轻柔清洗3-5次，除去肠绒毛细胞和漂浮脂肪组织。

4. 样本消化：在清洗好的小肠碎片组织加入10-15 mL含有3-5 mM EDTA（60163ES）的预冷DPBS中消化，4℃孵育30 min左右，期间每10 min轻摇一次离心管。

5. 消化完成后，弃去EDTA消化液上清，用新的DPBS缓冲液将组织轻柔漂洗2-3次以去除剩余的EDTA。

6. 在小肠组织碎片中加入10-15 mL预冷的含0.1% BSA（36101ES）的DPBS，反复吹打、重悬组织碎片，使隐窝与基底层分离，然后取少许悬液镜检，当看有大量隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液使用70 μm滤网（84702ES）过滤并收集穿过滤网的组织悬液。

7. 重复步骤5-6两次，1500 rpm、4℃离心3 min。

8. 混合物形成：用Ceturegel基质胶（40192ES）重悬隐窝组织沉淀，每10 μL基质胶悬液包含200-600个隐窝，重悬后混合液置于冰上，尽快操作以避免基质胶形成凝胶。

   注意：基质胶稀释比例≥ 50%以保证培养过程中Ceturegel基质胶结构的稳定性。

9. 将混合悬液种植于24孔板底部正中央，每孔30-50 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

10. 将种植后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

11. 待Ceturegel基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的肠类器官培养基，每孔800 μL。

12. 将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。每3天更换一次新鲜培养基并监测类器官生长状态，一般小鼠小肠类器官在5-7天内形成。

培养5-7天或小肠类器官中央变黑时可进行传代，提前将12孔板（84012ES）或24孔板（84013ES）放于培养箱中孵育至少30 min。吸走待传代的培养液，加1 mL/孔冷的DPBS，1 min后挑起基质胶，用1 mL枪头（83080ES）将基质胶轻轻吹散，用注射器一次性吸走悬液，重复操作1次，将悬液加入5 mL离心管（83511ES）中，1200 rpm，4℃、5 min离心，弃上清，按每孔1∶3传代。

选择生长状态旺盛的类器官(一般传代后3-4天)，进行冻存，每两孔冻存一管。吸去培养液，加入1 mL细胞冻存培养液，用枪头将加入类器官回收液的基质胶吹散，后将悬液加到细胞冻存管（84105ES）中，放于冻存盒（84608ES）中，于-80℃冰箱放置1天，后转入液氮长期保存。

将24孔板放于培养箱预热30 min。取出液氮中的冻存管并置于37℃水浴锅中，当冻存液溶解时取出，用1 mL注射器抽吸一次，然后将细胞悬液转移到15 mL离心管（83506ES）中，1200 rpm、4℃，离心5 min，弃上清，加入5 mL冰DPBS重悬，重复上述离心步骤，弃上清。按照类器官培养的步骤铺板和培养。