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Topoisomerase I 助力5min完成克隆

拓扑异构酶(Topoisomerase) 是存在于细胞核内的一类酶，它们能够切断单链或双链DNA的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数，从而控制DNA的拓扑状态。DNA拓扑异构酶分为两类，I型DNA拓扑异构酶（DNA Topoisomerase I）和II型DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase II）。

Topoisomerase I是由美国科学家Stewart Shuman在1990年从牛痘病毒中发现的，同时具有限制性内切酶活性和连接酶活性，能够在DNA复制过程中切断并重新连接DNA。Topoisomerase I可以在无需ATP供能的情况下切断DNA链，在切割单链DNA后，会与末端DNA片段形成暂时性中间体，并在释放压力后重新连接切口。由于Topoisomerase I具有切断、连接DNA的这种特性，常被用于克隆载体的构建（如TOPO克隆）以及NGS 建库中的接头连接等。

图1. Topoisomerase I原理图^[1]

TOPO克隆

TOPO克隆是一种基于Topoisomerase I的PCR产物快速克隆系统，利用Topoisomerase I的连接原理，无需DNA连接酶，可在5 min内高效连接DNA片段。Topoisomerase I识别并切割TOPO载体上的结合位点，切割完成后，与TOPO载体结合形成复合物。目的DNA片段可在Topoisomerase I的作用下与TOPO载体连接，形成克隆。

技术路线

识别切割：Topoisomerase I识别DNA序列5’-(C/T)CCTT-3’，并且能够在该位点对DNA进行切割；

固定：Topoisomerase I借助DNA断裂的能量将酪氨酸残基与载体DNA 3’末端形成共价键，从而固定在DNA载体上；

连接：在加入目的DNA片段（PCR Product）后，目的DNA片段的5'端羟基攻击载体片段的磷酸键，释放能量，使得目的DNA片段的 5'端羟基与载体片段的3'端磷酸基团连接在一起；

脱落：Topoisomerase I从载体分子上脱落。