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干货│重组酶聚合酶扩增RPA技术——核酸扩增新选择

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一种新型核酸恒温扩增技术，可以在37~42 ℃条件下，10~30 min内实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测，可广泛应用于体外诊断、动物疫病、食品安全、生物安全、农业等领域。

RPA等温扩增技术优势

1. 检测灵敏度高：可将痕量的核酸模板（低至单拷贝）扩增至可以检出的水平，且通常无需进行核酸纯化。

2. 无需昂贵的配套仪器设备：37~42°C恒温反应，无须热循环，摆脱仪器束缚，方便快捷。

3. 样本耐受性高：适合复杂样本的扩增检测。例如未经核酸纯化的血液或鼻拭子，只需要通过热或碱进行预处理促进核酸释放即可。

4. 检测方法多样化：包括电泳法检测、荧光探针法检测、侧流层析试纸条检测等。

RPA等温扩增技术原理

RPA等温扩增技术依赖多种酶与蛋白的参与。RPA的反应过程中，首先重组酶蛋白与引物形成复合物（A），并在双链DNA中寻找同源序列（B）。然后通过重组酶的链置换活性将引物插入同源位点（C），并且单链结合蛋白稳定置换DNA链（D）。随后重组酶被分解，使得引物的3'末端被链置换并与聚合酶结合（E），使其延长引物（F），通过循环重复该过程对模板上的目标区域进行指数式扩增。

图1.RPA等温扩增技术原理图[1]

RPA等温扩增技术检测方法

1. 电泳法：在RPA的基础上，用凝胶电泳的技术进行终产物检测。

2. EXO探针法：在RPA的基础上，加入了核酸外切酶III（exonuclease III，即exo）和exo荧光探针，核酸外切酶III会特异地切割荧光探针（THF位点），然后荧光集团与淬灭集团分开，发出荧光信号，通过荧光收集的仪器来实时监控荧光值的变化。

图2.EXO探针法检测原理图[2]

3. Fpg探针法：在RPA的基础上，加入甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶（fgp）及fpg荧光探针，当探针与模板结合时，fpg酶识别dR连接臂（dR group）并切割该位点，使得荧光基团与淬灭集团分开，发出荧光信号，通过荧光收集的仪器来实时监控荧光值的变化。

图3.EXO探针法检测原理图[2]

4. 侧流层析试纸条（LF-RPA）：在RPA的基础上，加入核酸外切酶Ⅳ（endonuclease Ⅳ，即nfo）、nfo探针和生物素标记的反向引物。当nfo探针与模板链互补时，nfo酶识别并切割THF位点，扩增获得既有探针标记物又有引物标记物的扩增子。通过侧流层析法如抗体或抗体/链霉抗生物素蛋白夹心法鉴定结果。

图4.EXO探针法检测原理图[1]

5. 絮凝分析检测：RPA扩增子在低pH缓冲条件下与磁珠一起孵育，磁珠表面上沉淀的RPA扩增子交联其他扩增子-磁珠形成共轭体，从而絮凝出溶液。同时絮凝现象的产生只能由长度超过100个核苷酸的扩增子触发。没有靶标的模板进行RPA反应不会产生长的“DNA聚合物区段”因而不会发生絮凝，絮凝分析是常用的终点检测方法，肉眼可视化效果好，可用于RPA扩增子的快速定性检测。

图5.RPA絮凝分析检测原理图[3]

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产品名称	产品货号	产品作用
Bsu DNA polymerase (Large fragment,5 U/μL)	11078ES	结合引物与原始靶核酸序列互补合成新的DNA模板
T4 UvsX Recombinase	11079ES	具有配对和链转移活性的重组酶
T4 UvsY protein	11080ES	重组酶辅助因子，刺激T4 UvsX的单链DNA依赖性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX临界浓度
T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌体基因32编码蛋白	11081ES	参与DNA复制、修复、重组与解链后的单链DNA结合，防止自杂交
Creatine Kinase 肌酸激酶	14502ES	刺激ATP和肌酸分解为磷酸肌酸和ADP，释放能量
Exonuclease III	14525ES	具有3'→5'外切酶活性，切断荧光探针中淬灭基团，释放荧光

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参考文献

[1] 施奕,徐昌平,余蓓蓓,卢亦愚,梅玲玲.重组酶聚合酶扩增技术研究进展[J].病毒学报, 2020,36(03):522-532.

[2] Li J, Macdonald J, von Stetten F. Review: a comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification. Analyst. 2018 Dec 17;144(1):31-67. doi: 10.1039/c8an01621f. Erratum in: Analyst. 2020 Mar 2;145(5):1950-1960. PMID: 30426974.

[3] Wee EJ, Lau HY, Botella JR, Trau M. Re-purposing bridging flocculation for on-site, rapid, qualitative DNA detection in resource-poor settings. Chem Commun (Camb). 2015 Apr 7;51(27):5828-31. doi: 10.1039/c4cc10068a. Epub 2015 Jan 26. PMID: 25622026.

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