一、开发目的

利用中国CDC和WHO指导文件中相关基因的引物和探针，依次验证质粒标准品、假病毒标准品，筛选出适合新冠病毒的RNA扩增试剂。

二、开发策略

将检测灵敏度和特异性作为RT-PCR探针法检测试剂的核心指标，筛选出了灵敏度至少达到10 copies (20 μL反应体系)，高特异性判别新冠病毒ORF1ab、N gene和E gene的候选配方。

图1. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene质粒为模板，模板投入量10⁷-10¹拷贝数，采用CDC建议引物和探针，进行单管多重扩增检测。在此过程中，根据引物和探针属性，优化扩增程序。

图3. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量10⁷-10³ copies/mL，采用中国CDC建议引物和探针，进行单管多重扩增检测。

3. 试剂稳定性测试

将试剂保存条件的容忍度和批次稳定性作为试剂稳定性的评估指标，测定该配方批次间和批次内CV值＜5%，可反复冻融次数50次，4℃，25℃保存一周，性能无变化，保证了质量稳定可靠。

图4. 生产批次：H1029950。以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量10⁷-10³ copies/mL，进行单管多重扩增检测，比较Ct值和扩增曲线线型。

图5. 生产批次：H1029950、H1029920、H1025890。以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量10⁷-10³ copies/mL，进行单管多重扩增检测，比较Ct值和扩增曲线线型。

图6. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量10⁶-10³ copies/mL，进行单管多重扩增检测，比较4℃、25℃保存1-7天后Ct值和扩增曲线线型。

图7. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量10⁶-10³ copies/mL，进行单管多重扩增检测，比较反复冻融50次处理后Ct值和扩增曲线线型。