细胞转染 | 骨髓巨噬细胞(BMDM)原代提取培养与转染实验方案
实验所用试剂清单
|
试剂名称 |
货号 |
|
Hieff Trans® LipoBooster 3000 Transfection Reagent Lipo3000转染试剂 |
40801ES |
|
41405ES |
|
|
DMEM High Glucose Medium DMEM高糖培养基（含L-谷氨酰胺，丙酮酸钠110 mg/L；不含HEPES，双抗） |
41401ES |
一、细胞提取及培养
1、准备工作：
1) 小鼠处理：脱颈处死后，放入75%酒精浸泡约10 min；
2) 实验用品：洁净10 cm培养皿若干，用于实验中PBS组织浸泡；孔板，用于培养BMDMs及转染；DMEM培养基，无菌PBS，红细胞裂解液；2.5 mm注射针头和20 mL注射器，用于冲出小鼠骨髓中细胞；离心管；剪刀镊子；
2、细胞提取：
1) 培养皿中加入可以没过小鼠腿的PBS；
2) 沿小鼠大腿根部剪掉小鼠整条腿，剪去脚掌，不得剪碎两根主要腿骨，防止骨髓外流，污染细胞，将剪好的腿放到培养皿中浸泡，注意一个鼠一个皿，不可混放，防止细胞污染；
3) 剃净骨头上的肉，分离关节，一腿两节放入装有干净的PBS培养皿中；
4) 剃净的骨头用75%酒精浸泡2 min，杀菌消毒；
5) 用PBS将骨头上的酒精冲洗干净；
6) 剪开关节，用注射器向骨头中注射PBS，将骨髓冲入离心管中，一般一根骨头5 mL PBS；
7) 1500 rpm，8 min离心1次倒去上清；
8) 加入红细胞裂解液，裂红后1500 rpm，8 min离心1次倒去上清；
9) 加入培养基吹起底部细胞（培养基体积根据具体使用孔板进行计算），加入M-CSF（终浓度为25 ng/mL），将细胞悬液直接加入孔板中，诱导分化成巨噬细胞；
10) 摇晃孔板，均匀细胞分布
3、细胞培养：
记提取日为Day0，在BMDMs提取后的Day3、Day5以及Day7换液，换液应注意不得用力吹打，应沿培养皿壁缓缓吸出！
Day3换液过程：
1) 吸出全部培养液，补加孔板容量的一半的新的DMEM；
2) 吸出的培养液1500 rpm，8 min离心，取上清液一半加回孔板内；
3) 补加M-CSF（每孔终浓度为25 ng/mL）。
Day5及Day7换液过程：
1) 吸出全部培养液，补加孔板容量的一半的新的DMEM；
2) 吸出的培养液1500 rpm，8 min离心，倒去一半上清，剩下重悬细胞后，加回孔板内；
3) 补加M-CSF（每孔终浓度为25 ng/mL）。
二、细胞转染实验
在Day7直接在培养孔板中进行转染实验。按照以下实验方法进行操作。
1、 DNA转染
注：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。
1） 细胞铺板，至转染操作时，以细胞融合度达70%-90%为佳。
2） 按照下表使用Opti-MEM培养基稀释LipoBooster 3000转染试剂溶液，轻轻混匀。
3） 使用Opti-MEM培养基稀释DNA，得到DNA预混液，然后添加Enhancer转染增强剂溶液，轻轻混匀，得到稀释的DNA。
4） 将稀释的DNA加入已稀释的LipoBooster 3000转染试剂溶液中(1:1比例)。
5） 室温孵育10-15分钟。
6） 将DNA-转染试剂复合物逐滴加到细胞中，轻轻混匀。
2、 siRNA转染
转染siRNA操作与DNA的转染操作流程一样，但在稀释siRNA时则不需要加入Enhancer转染增强剂。
3、 mRNA转染
转染mRNA操作及用量与DNA的转染操作流程一样，但在稀释mRNA时则不需要加入Enhancer转染增强剂。
不同细胞培养容器转染用量（仅供参考）：
|
培养容器 |
培养基用量 |
DNA转染 |
siRNA转染（终浓度50 nM） |
||||
|
培养基体积 |
复合物中Opti-MEM体积 |
DNA（μg） |
LipoBooster 3000转染试剂（μL） |
Enhancer转染增强剂（μL） |
siRNA体积（初始浓度20 μM） |
LipoBooster 3000转染试剂（μL） |
|
|
96孔 |
100 μL |
2×5 μL |
0.1 |
0.2 |
0.2 |
0.25 μL |
0.3 |
|
48孔 |
250 μL |
2×12.5 μL |
0.25 |
0.5 |
0.5 |
0.625 μL |
0.75 |
|
24孔 |
500 μL |
2×25 μL |
0.5 |
1 |
1 |
1.25 μL |
1.5 |
|
12孔 |
1 mL |
2×50 μL |
1 |
2 |
2 |
2.5 μL |
3 |
|
6孔 |
2 mL |
2×125 μL |
2.5 |
5 |
5 |
5 μL |
7.5 |
|
60 mm |
5 mL |
2×250 μL |
5-10 |
10-20 |
10-20 |
12.5 μL |
20 |
|
10 cm |
10 mL |
2×500 μL |
15-25 |
30-50 |
30-50 |
25 μL |
40 |
|
T25 |
6 mL |
2×250 μL |
6-12 |
12-24 |
12-24 |
15 μL |
24 |
|
T75 |
15 mL |
2×750 μL |
20-40 |
40-80 |
40-80 |
37.5 μL |
60 |
【注】该表使用量仅供参考，DNA与LipoBooster 3000转染试剂溶液具体使用量还需根据细胞类型及其他实验条件进行优化。
建议使用时比值保持在1:0.5-1:5之间。其中mRNA的用量及实验条件和DNA一致；若细胞比较脆弱，导致细胞死亡较多，可以通过将增强剂减半来获得更好的结果。
三、细胞转染结果测试
当使用绿色荧光蛋白（GFP）作为测试蛋白时，使用荧光显微镜及流式细胞仪进行测试；当使用荧光素酶（Luc）作为测试蛋白时，使用荧光素酶底物试剂盒进行测试。
1、荧光显微镜观察
将孔板置于荧光显微镜下观察GFP的表达。
2、流式细胞仪分析
1) 用细胞刮刀将孔内细胞分离；
2) 吸出细胞悬液到离心管内，1500 rpm，8 min离心，倒去上清；
3) 每管加入1 mL PBS重悬细胞，将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，1500 rpm，8 min离心，倒去上清；
4) 加入100 μL PBS重悬细胞，加入流式抗体，涡旋，4℃静置10-30 min，对巨噬细胞进行染色；
5) 染色结束后，每管加入1 mL PBS，1500 rpm，8 min离心，倒去上清；
6) 每管加入1 mL PBS，1500 rpm，8 min离心，倒去上清；
7) 每管加入一定量的PBS（200-300 μL），涡旋，进行流式检测。
3、荧光素酶底物试剂盒测试
1) 除去孔内原有培养基；
2) 每孔加入组织细胞裂解液，裂解细胞；
3) 根据对应试剂盒说明书进行荧光素酶表达水平测试。
四、实验结果
使用5981cc万洲国际 LipoBooster 3000 和进口品牌T3000转染试剂同时在原代巨噬细胞BMDM中转染质粒DNA，
结果显示，5981cc万洲国际 LipoBooster 3000 转染试剂转染效均优于进口品牌T3000
