HieffNGS®UltimaDNALibraryPrepKitforIllumina®是针对Illumina®高通量测序平台定向优化而成的新一代建库试 剂盒。作为全新的升级版本，本产品采用高质量的酶学组成，简化的操作流程，可显著提高低质量样本文库转化率与扩增 效率，具有广泛的样本适应性，同时兼容FFPE、cfDNA、ChIPDNA等样本，助力获得优异的测序数据。 适用500pg-1μgDNA样本 兼容cfDNA、FFPE等低质量样本 高效的文库转化率与扩增效率 多样本验证可获得优异的文库与测序数据 严格的批次性能与稳定性质控 产品组分 组分编号与名称13489ES0813489ES2413489ES96 13489-AEndprepMix80μL240μL960μL 13489-BLigationEnhancer240μL720μL4×720μL 13489-CFastT4DNALigase40μL120μL480μL 13489-D2×UltimaAmplificationMix200μL600μL4×600μL 13489-EPrimerMix40μL120μL480μL
冰袋运输。所有组分-20°C保存，有效期1年。 注意事项 一、关于操作 1.本产品仅作科研用途！为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。 3.配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。 4.为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。 5.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。 6.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化 检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂 白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。 二、关于DNA片段化 1.本试剂盒中兼容机械法及酶切法片段化的DNA。 2.本试剂盒兼容范围为500pg–1μgInputDNA。应尽可能使用A260/A280=1.8-2.0的高质量InputDNA。表1中列举了将 本试剂盒应用于常见应用中推荐的InputDNA量。 网址：www.yeasen.com第2页，共8页 表1常见应用中推荐InputDNA量 应用样本类型推荐InputDNA量 全基因组测序复杂基因组50ng-1μg 靶向捕获测序复杂基因组10ng-1μg 全基因组测序，靶向捕获测序FFPEDNA≥50ng 全基因组测序，靶向捕获测序cfDNA/ctDNA≥500pg 全基因组测序微生物基因组≥1ng 全基因组测序PCR-free测序高质量DNA≥100ng 免疫共沉淀测序ChIP-DNA≥500pg 靶向测序扩增子≥500pg 【注】：上表为使用高质量DNA时推荐的InputDNA量，当InputDNA质量较差或需要进行片段分选时，应适当上调使用量。 3.InputDNA特指投入末端修复/dA尾添加步骤中的DNA。 4.InputDNA制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响末端修复/dA尾添加步骤反应效率，建议 DNA片段化后进行磁珠纯化或分选。当使用机械法进行DNA片段化且产物不进行纯化或长度分选而直接建库时，请将 DNA稀释在TEBuffer中进行片段化，请勿在灭菌超纯水中进行。当使用酶切法进行片段化且产物不进行纯化或长度分选 而直接建库时，请确认StopBuffer中不包含过量的金属离子螯合剂。如条件不满足，可先将片段化产物纯化或长度分选 后溶于TEbuffer或灭菌超纯水中(≤50μL)，再进行文库构建。 三、关于接头连接(AdapterLigation) 1.本公司可提供长接头(IndexedAdapter)试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求 进行选择。 目前有48种CompleteAdapters:HieffNGS®CompleteAdapterKitforIllumina®,Set1~Set4(Cat#12615~Cat#12618)； 单端96种IndexPrimers:HieffNGS®96SingleIndexPrimersKitforIllumina®,Set1~Set2(Cat#12611~Cat#12612)； 双端384种IndexPrimers:HieffNGS®384DualIndexPrimersKitforIllumina®,Set1~Set2(Cat#12613~Cat#12614)。 2.Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多AdapterDimer；用量较低 可能会影响连接效率及文库产量。表2列举了使用本试剂盒，不同InputDNA量推荐的Adapter使用量。 表2500pg-1μgInputDNA推荐的Adapter使用浓度 InputDNAAdapter:InputDNA摩尔比InputDNAAdapter:InputDNA摩尔比 1μg10:150ng100:1 500ng20:125ng200:1 250ng40:11ng200:1 100ng100:1500pg400:1 【注】：InputDNA摩尔数(pmol)≈InputDNA质量(ng)/[0.66×InputDNA平均长度(bp)]。 四、关于磁珠纯化与分选(Bead-basedCleanUpandSizeSelection) 1.DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。 2.当InputDNA质量≥50ng，您可选择在接头连接后分选；如InputDNA质量<50ng，建议您在文库扩增后进行分选。 3.LigationEnhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮磁珠分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须 先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠 分选步骤。 4.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。 5.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。 6.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。 7.磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。 8.进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。 网址：www.yeasen.com第3页，共8页9.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进 而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5min足以让磁珠充分干燥。 10.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱，产物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1个月。 五、关于文库扩增(LibraryAmplification) 1.是否需要进行文库扩增取决于InputDNA量、Adapter是否为完整长度、应用需要等因素。如使用非完整长度Adapter， 必须进行这一步骤。如使用完整长度Adapter，当InputDNA<200ng时，推荐进行文库扩增；当InputDNA≥200ng或者 不需要进行文库扩增时，可不进行文库扩增。 2.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、 重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表3列举了本试剂盒，获得100ng或1000ng文库的所需循 环数。 表3500pg-1μgInputDNA获得100ng或1000ng产物扩增循环数推荐表 InputDNANumberofcyclesrequiredtogenerate 100ng1000ng 1μg-2-4* 500ng-3-5 250ng1-3*4-7 100ng2-4*5-8 50ng4-67-10 10ng6-88-12 5ng7-910-14 1ng9-1112-15 500pg11-1313-16 【注】：*如果使用了不完整的接头，需要扩增1-3个循环，形成完整的接头。建库过程中进行过长度分选时参照较高循环数扩增。 六、关于文库质检(LibraryQualityAnalysis) 1.通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。 2.文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。 3.文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。 4.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效 区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩 增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文 库的干扰。 5.文库长度分布检测，可通过AgilentBioanalyzer2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。 使用方法 一、自备材料 1.纯化磁珠：Cat#12601，HieffNGS®DNASelectionBeads或Cat#A63880，AMPureXPBeads或其他等效产品。 2.DNA质控：AgilentTechnologies2100Bioanalyzer或其他等效产品。 3.DNAAdapter：可选YeasenCompleteAdapter:HieffNGS®CompleteAdapterKitforIllumina®,Set1-4(Cat#12615-12618); 单端96种IndexPrimers:HieffNGS®96SingleIndexPrimersKitforIllumina®,Set1-2(Cat#12611~Cat#12612)； 双端384种IndexPrimers:HieffNGS®384DualIndexPrimersKitforIllumina®,Set1-2(Cat#12613~Cat#12614)。 或其他等效产品。 4.其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TEBuffer(10mMTris-HCl(pH8.0-8.5),0.1mMEDTA)、低吸附EP管、PCR管、 磁力架、PCR仪等。 网址：www.yeasen.com第4页，共8页二、操作流程 图1UltimaDNA建库试剂盒操作流程 三、操作步骤 3.1末端修复/dA尾添加(EndRepair/dA-Taling) 该步骤将InputDNA末端补平，并进行5’端磷酸化和3’端加dA尾。 1.将表4中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。 2.于无菌PCR管中配制表4所示反应体系。 表4末端修复/dA尾添加PCR反应体系 名称体积(μL) FragmentedDNAx EndprepMix10 ddH2OUpto60 3.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。 4.将上述PCR管置于PCR仪，设置表5所示反应程序，进行末端修复/dA尾添加反应。 表5末端修复/dA尾添加PCR反应程序 温度时间 热盖105°COn 30°C20min 72°C20min 4°CHold 3.2接头连接(AdapterLigation) 该步骤将3.1步骤的产物末端，连接特定的Illumina®接头。 1.根据InputDNA量按表2稀释Adapter至合适浓度。 2.将表6中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 3.于3.1步骤PCR管中配制表6所示反应体系。 网址：www.yeasen.com第5页，共8页 表6AdapterLigationPCR体系 名称体积(μL) dA-tailedDNA（3.1步骤产物）60 LigationEnhancer30* FastT4DNALigase5 DNAAdapter5** 【注】：*LigationEnhancer比较粘稠，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时后离心使用。 **本公司接头浓度与常规商业化试剂盒一致，皆为15μM。 【接头添加计算举例】：当InputDNA为100ng，InputDNA长度为300bp时，接头应该添加多少？ 第一步，计算InputDNA摩尔数。公式：InputDNA摩尔数(pmol)≈InputDNA质量(ng)/[0.66×InputDNA平均长度(bp)]； InputDNA摩尔数(pmol)=100÷(0.66×300)=0.5pmol； 第二步，计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表2查询接头添加比例； 根据表2，查得InputDNA100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5pmol=50pmol； 第三步，计算接头添加体积。接头浓度=15μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）； 接头添加体积=接头添加摩尔数(50pmol)÷接头浓度(15μmol/L)=3.34μL（注：15μmol/L=15pmol/μL) 综上，接头可添加3.4μL，加1.6μL水补齐至5μL。（注：接头最大加入体积不超过5μL）。 4.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 5.将PCR管置于PCR仪中，设置表7所示反应程序，进行接头连接反应： 表7AdapterLigationPCR反应程序 温度时间 热盖105°COff 20°C15min 4°CHold 【注】：当InputDNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。 3.3连接产物磁珠纯化(Post-LigationCleanUp) 该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或AdapterDimer等无效产物。 3.3.1纯化操作步骤 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取60μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至AdapterLigation产物中，涡旋混匀或移液器吹 打10次混匀，室温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 8.将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱： 1)如产物无需进行片段分选，直接加入21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。 【注：如纯化产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min）， 小心移取20μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。 2)如产物需进行双轮分选，加入102μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。【注： 如纯化产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min）， 小心移取100μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。 网址：www.yeasen.com第6页，共8页3.3.2双轮分选操作步骤 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡约30min。配制80%乙醇。 2.请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。 3.根据DNA片段长度要求，参考表8向上述100μLDNA上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混 匀。 表8磁珠文库分选推荐比例 DNA文库插入片段大小150-250bp200-300bp300-400bp400-500bp500-600bp DNA文库大小250-350bp350-450bp450-550bp550-650bp650-750bp 第一轮体积比(Beads:DNA)0.80×0.70×0.60×0.55×0.50× 第二轮体积比(Beads:DNA)0.20×0.20×0.20×0.15×0.15× 【注】：表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250bp，样品DNA体积为100μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.70×100μL=70μL； 第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100μL=20μL；表中所推荐比例是针对于AdapterLigatedInsertDNA(PostLigation)，如果用户在接头连接前进行 分选，请采用HieffNGS®DNASelectionBeads(Cat#12601)说明书中推荐的比例。 4.室温孵育5min。 5.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心转移上清到干净的离心管中。 6.参考表8向上清中加入第二轮分选磁珠。 7.涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5min。 8.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 9.保持PCR管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。 10.重复步骤9。 11.保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5min）。 12.将PCR管从磁力架中取出，加入适量21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5min。 13.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5min），小心转移20μL上清至干净的管中。 3.4文库扩增(LibraryAmplification) 该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。 1.将表9中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 2.于无菌PCR管中配制表9所示反应体系。 表9PCR扩增反应体系 名称体积(μL) 2×UltimaAmplificationMix25 PrimerMix5 AdapterLigatedDNA（3.3步骤产物）20 3.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 4.将PCR管置于PCR仪中，设置表10所示反应程序，进行PCR扩增。 表10PCR扩增反应程序 温度时间循环数 98°C1min1 98°C10sec 参照注意事项中表360°C30sec 72°C30sec 72°C5min1 4°CHold- 网址：www.yeasen.com第7页，共8页3.5扩增产物磁珠纯化或分选(Post-AmplificationCleanUp/SizeSelection) 同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用HieffNGS®DNASelectionBeads(0.9×，Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。 如需分选，操作方法同3.3.2双轮分选步骤（纯化步骤可省略）。 3.6文库质量控制 通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。 3.7参考实例 使用HieffNGS®UltimaDNALibraryPrepKitforIllumina®对100ngFFPE样本建库（未分选），结果使用Agilent2100DNA 1000Chip进行检测。 图2UltimaDNA建库试剂盒用于FFPE样本建库（未分选） 网址：www.yeasen.com第8页，共8页备忘录: __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________
