HieffNGS®Dual-modeRNALibraryPrepKitforIllumina®是用于Illumina®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒，包含 RNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性dscDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA 去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二 链合成buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿 嘧啶的DNA模板，实现链特异性。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构 建的稳定性和重复性。 产品组分 组分编号和名称12251ES0812251ES2412251ES96 12251-AFrag/PrimeBuffer150μL450μL2×900μL 12251-B1stStrandEnzymeMix16μL48μL192μL 12251-CStrandSpecificityReagent50μL150μL580μL 12251-D2ndStrandBuffer(dNTP)240μL720μL2×1440μL 12251-E2ndStrandBuffer(dUTP)240μL720μL2×1440μL 12251-F2ndStrandEnzymeMasterMix40μL120μL480μL 12251-GLigationEnhancer240μL720μL2×1440μL 12251-HQuickT4DNALigase40μL120μL480μL 12251-I2×SuperCanace®IIHigh-FidelityMix200μL600μL2×1200μL 12251-JPrimerMix40μL120μL480μL

干冰运输；-20°C保存；有效期1年。 注意事项 一、关于操作 1.本产品仅作科研用途！为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。 3.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。 4.请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去 除RNA酶污染。 5.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测 区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的 DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。 6.本产品仅作科研用途！ 二、关于接头连接(AdapterLigation) 1.本公司可提供长接头(IndexedAdapter)试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求网址：www.yeasen.com第2页，共12页进行选择。目前有48种IndexedAdapters:HieffNGS®CompleteAdapterKitforIllumina®,Set1~Set4(Cat#12615~Cat#12618)； 单端96种IndexPrimers:HieffNGS®96SingleIndexPrimersKitforIllumina®,Set1~Set2(Cat#13519~Cat#13520)；双端384 种IndexPrimers:HieffNGS®RNA384CDIPrimerforIllumina®,Set1~Set2(Cat#12414~Cat#12415)。 2.我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的 防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。 3.使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解 链。 4.建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5μL，请 根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15μM，接头稀释液请选择0.1×TEbuffer， 稀释过的接头可在4°C保存48h。 表1InputTotalRNA量与接头使用浓度推荐表 InputTotalRNAAdapterstockconcentration 100ng1.5μM 500ng3μM ≥1μg5μM 三、关于文库扩增(LibraryAmplification) 1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性， 即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。 2.如果您使用IndexedAdapter（也称为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物Primermix进行扩增；如果使 用的是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用IndexPrimers进行扩增，加上相应的Index。 3.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重 复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，InputTotalRNA量与 相应扩增循环数的推荐。 4.表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求，若您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可根据实际情况适当 增加循环数。mRNA建库时请特别注意，由于不同物种和组织所提取的TotalRNA中，mRNA的含量差异较大，实验中需 根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。 表2InputTotalRNA量与扩增循环数推荐表* InputTotalRNANumberofcycles Non-strandedStranded 100ng1617 500ng1415 1μg1214 【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑， 选择最合适的建库条件。 四、DNA磁珠纯化与分选(Bead-basedCleanUpandSizeSelection) 1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用HieffNGS®DNASelectionBeads(YeasenCat#12601)或 AMPure®XP磁珠(BeckmanCat#A63880)进行DNA纯化和分选。 2.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。 3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。 4.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。 5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。网址：www.yeasen.com第3页，共12页6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而 降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5min足以让磁珠充分干燥。 7.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TEBuffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。 五、关于文库质检(LibraryQualityAnalysis) 1.通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。 2.文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。 3.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接 Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样 品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。 4.文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。 5.文库长度分布检测，可通过AgilentBioanalyzer2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。 六、自备材料(OtherMaterials) 1.mRNA富集试剂盒：HieffNGS®mRNAIsolationMasterKit(YeasenCat#12603)。 2.rRNA去除试剂盒：HieffNGSMaxUpHumanrRNADepletionKit(rRNA&ITS/ETS)(YeasenCat#12257)。 3.RNA纯化磁珠：HieffNGS®RNACleaner(YeasenCat#12602)或其他等效产品。 4.DNA纯化磁珠：HieffNGS®DNASelectionBeads(YeasenCat#12601)或AMPure®XPBeads(A63880)或其他等效产品。 5.RNA质控：Agilent2100BioanalyzerRNA6000Nano/PicoChip或其他等效产品。 6.Adapters：含Index的长接头(YeasenCat#12615~12618)或者短接头（YeasenCat#12414~12415）。 7.文库质检：Agilent2100BioanalyzerDNA1000Chip/HighSensitivityChip或其他等效产品；文库定量试剂。 8.其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。 使用方法 图1RNA链特异文库建库操作流程网址：www.yeasen.com第4页，共12页Part1：目标RNA的富集和片段化 该步骤是建库前的目标RNA制备，根据建库需求可选择Poly(A)mRNAIsolation方案（方案A）或rRNADepletion方案（方 案B）。YeasenCat#12251建库模块不包含该步骤所用试剂，请客户根据建库需要自备相应的试剂。 方案A：mRNA纯化和片段化 样本要求 该方案使用HieffNGS®mRNAIsolationMasterKit(YeasenCat#12603)进行mRNA富集。适用于起始模板量为0.1-4μg （体积≤50μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50μL，可使用HieffNGS® RNACleaner(YeasenCat#12602)磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent2100BioanalyzerRNA6000Nano/Pico芯片检测，RIN 值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo(dT)磁珠，只有带poly(A) 尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外， FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。 操作步骤 1.将mRNACaptureBeads从2-8°C取出，静置使其温度平衡至室温，约30min。 2.准备一个Nucleasefree离心管，取0.1-4μg总RNA，用Nucleasefree水将体积补至50μL，冰上放置备用。 3.颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50μL磁珠悬液加入至50μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。 4.将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65°C，5min；4°C，hold，使得RNA变性。 5.室温孵育5min，使mRNA与磁珠完全结合。 6.将样品置于磁力架中，室温静置5min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。 7.将样品从磁力架上取出，用200μLBeadsWashBuffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中， 室温静置5min，小心移除上清。 8.重复步骤7，共洗涤两次。 9.将样品从磁力架上取出，加入50μLTrisBuffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。 10.将样品置于PCR仪中，80°C，2min；25°C，hold，将mRNA洗脱下来。 11.将样品从PCR仪中取出，加入50μLBeadsBindingBuffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。 12.室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。 13.将样品置于磁力架中，室温静置5min，小心移除上清。 14.将样品从磁力架上取出，用200μLBeadsWashBuffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回 至磁力架中，室温静置5min，吸掉全部上清。 【注】：最后需要用10μL移液器吸干净残留液体。 15.将样品从磁力架上取出，用18.5μLFrag/Primebuffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中 （预设为94°C或85°C），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做 个片段化时间的梯度，比如94°C，5min或85°C，6min。使用Agilent2100分析双链cDNA纯化产物大小。 表3mRNA片段化程序推荐 插入片段大小(bp)打断程序 150-20094℃，6min；4℃，Hold 200-30094℃，5min；4℃，Hold 250-45085℃，8min；4℃，Hold 400-55085℃，6min；4℃，Hold 16.片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17μL上清 至一个新的nucleasefree离心管中，立刻进入第一链合成反应(Part2-Step1)。 方案B：rRNA去除与RNA片段化 样本要求网址：www.yeasen.com第5页，共12页该方案使用HieffNGSMaxUpHumanrRNADepletionKit(rRNA&ITS/ETS)(YeasenCat#12257)去除TotalRNA中的 rRNA。适用于人、小鼠、大鼠来源的100ng~1μg（体积≤11μL）总RNA样品；适用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）样品。 操作步骤 Step1探针杂交 1.将探针和杂交Buffer从-20°C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 2.准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用NucleasefreeH2O稀释至11μL。 3.按照表4于200μLPCR管中配制rRNA去除反应体系。 表4探针杂交反应体系 名称体积(μL) HybridizationBuffer3 ProbeMix(H/M/R)1 TotalRNA100ng~1μg Total15 4.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。 5.将上述PCR管置于PCR仪（可设置梯度降温）中，按照表5所示反应程序，进行探针杂交反应。 表5探针杂交反应程序 温度时间 热盖105°COn 95°C2min 95-22°C0.1°C/sec 22°C5min 4°Chold Step2RNaseH消化 1.将RNaseH消化试剂从-20°C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表6所示，配制RNaseH消化反应体系。 表6RNaseH消化反应体系 名称体积(μL) RNaseHBuffer3 RNaseH2 上步产物15 Total20 2.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。 3.将上述PCR管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖55℃，On；37°C，30min；4°C，hold，进行RNaseH消化反应。 Step3DNaseI消化 1.将DNaseI消化试剂从-20°C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表7所示，配制DNaseI消化反应体系。 表7DNaseI消化反应体系 名称体积(μL) DNaseIBuffer27.5 DNaseI2.5 上一步产物20 Total50 2.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。 3.将上述PCR管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖55℃，On；37°C，30min；4°C，hold，进行DNaseI消化反应。网址：www.yeasen.com第6页，共12页Step4RNA纯化 1.准备工作：将HieffNGS®RNACleaner(YeasenCat#12602)磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。用NucleasefreeH2O 配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取110μLHieffNGS®RNACleaner(2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育5min。 4.将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μLNucleasefreeH2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小 心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。用10μL移液器吸干净残留液体。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠(5~10min)。 8.RNA洗脱：将PCR管从磁力架上取下，加入18.5μLFrag/Primebuffer，使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。 9.将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3min），小心移取17μL上清至新的NucleasefreePCR管 中，进行RNA片段化。 10.RNA片段化条件需根据样本质量进行调整，高质量的RNA样本，片段化条件可参考mRNA片段化条件（表3）。表8 推荐了FFPE不同质量样本的片段化条件。但不同的样本片段化效果会存在一定的差异，客户可根据自己的样本情况，做不 同片段化条件对比，选择合适的片段化条件。 11.片段化结束请立即置于冰上，进入一链合成反应(Part2-Step1)。 表8FFPERNA片段化条件推荐 DV200*片段化程序 >70%85°C，7min；4℃，Hold 50%~70%85°C，5min；4℃，Hold 20%~50%85°C，3min；4℃，Hold <20%（风险建库）85°C，3min或65°C，5min；4℃，Hold 【注】：*降解RNA的样本质量使用DV200指标判断，详见附录二说明 Part2：RNA文库构建 Step1第一链cDNA的合成(1stStrandSynthesis) 该步骤将已经富集/片段化的目标RNA合成一链cDNA。目标RNA的富集可根据实验需求和样本情况选择Poly(A)mRNA isolation方案或rRNADepletion方案，详见Part1。 1.将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表9所示，配制第一链cDNA合成的反应液。 表9第一链cDNA合成反应体系 名称体积(μL) Frag/PrimeBufferwithFragmentedRNA17 StrandSpecificityReagent6 1stStrandEnzymeMix2 Total25 2.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。 3.将上述PCR管置于PCR仪中，按照表10所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA 的合成。网址：www.yeasen.com第7页，共12页表10第一链cDNA合成反应程序 温度时间 热盖105°COn 25°C10min 42°C15min 70°C15min 4°CHold Step2第二链cDNA的合成/末端修复/加A(2ndStrandSynthesis/dA-Tailing) 1.将第二链合成试剂从-20°C取出，解冻后颠倒混匀；按照表11所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。 表11第二链cDNA合成反应体系 名称体积(μL) 1stStrandcDNA25 2ndStrandBuffer(dNTPordUTP)*30 2ndStrandEnzymeMasterMix5 Total60 【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的buffer。 2.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。 3.将上述PCR管置于PCR仪中，按照表12所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。 表12第二链cDNA合成反应程序 温度时间 热盖105°Con 16°C30min 72°C15min 4°CHold Step3接头连接(AdapterLigation) 该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina®接头。 1.参考注意事项二中的表1，根据InputRNA量，稀释Adapter至合适浓度。 2.将表13中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 3.于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表13所示反应体系。 表13AdapterLigation体系 名称体积(μL) dA-tailedDNA60 LigationEnhancer30* QuickT4DNALigase5 DNAAdapter5** Total100 【注】：*LigationEnhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。 **本公司接头原始浓度为15μM,请根据注意事项二表1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5μL。 4.使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 5.将PCR管置于PCR仪中，设置表14所示反应程序，进行接头连接反应：网址：www.yeasen.com第8页，共12页表14AdapterLigation反应程序 温度时间 热盖Off 20°C15min 4°CHold Step4连接产物纯化和片段大小分选(CleanUpPostLigationandSizeSelection) 目前有两个方案应用于该步骤，当插入片段＜200bp时，使用方案A，通过两次纯化去除体系中的接头残留；当插入片 段≥200bp时，使用方案B，通过纯化、分选获得目标长度的文库。 方案A：适用于插入片段<200bp的文库（需进行两轮纯化） 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取60μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至AdapterLigation产物中，涡旋或吹打混匀，室温 孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 8.将PCR管从磁力架中取出，加入52μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3min），小心移取50μL上清至新PCR管中，再进行一轮纯化。 9.吸取40μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.8×，Beads:DNA=0.8:1)至上一步产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5min。 10.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3min），小心移除上清。 11.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 12.重复步骤11，总计漂洗两次。 13.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 14.将PCR管从磁力架中取出，加入21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3min），小心移取20μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。 方案B：适用于插入片段大于200bp的文库（先纯化，再分选） 方案B-1：接头连接产物的纯化 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取60μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至AdapterLigation产物中，涡旋或吹打混匀，室温 孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 8.将PCR管从磁力架中取出，加入102μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min），小心移取100μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。 【注】：LigationEnhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响，所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。 方案B-2：双轮分选 1.请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。 2.根据DNA片段长度要求，参考表15，在上述100μLDNA中加入第一轮分选磁珠，涡旋或移液器吹打10次混匀。网址：www.yeasen.com第9页，共12页表15文库分选推荐磁珠比例 DNA文库插入片段大小（峰值，bp）~200~300~400~500 短接头连接之后分选第一轮体积比0.80×0.65×0.60×0.54× 第二轮体积比0.20×0.15×0.15×0.10× 长接头连接之后分选或文 库扩增之后分选第一轮体积比0.74×0.62×0.56×0.52× 第二轮体积比0.15×0.15×0.15×0.10× 【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于HieffNGS®DNASelectionBeads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300bp时，若 在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100μL=65μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100μL=15 μL；若在长接头连接之后分选，样品DNA体积为100μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.62×100μL=62μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15μL。 3.室温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2μL溶液于 管底。 5.参考表15向上清中加入第二轮分选磁珠。 6.涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5min。 7.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3min），小心移除上清。 8.保持PCR管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。 9.重复步骤8。 10.保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3min）。 11.将PCR管从磁力架中取出，加入21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5min。 12.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3min），小心转移20μL上清至干净管中。 Step5文库扩增(LibraryAmplification) 该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。 1.将表16中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 2.于无菌PCR管中配制表16所示反应体系。 表16-A短接头连接产物PCR反应体系表16-B长接头连接产物PCR反应体系 组分名称体积(μL)组分名称体积(μL) 2×SuperCanace®IIHigh-FidelityMix252×SuperCanace®IIHigh-FidelityMix25 UniversalPrimer/i5Primer*2.5 PrimerMix**5 IndexPrimer/i7Primer*2.5 AdapterLigatedDNA20AdapterLigatedDNA20 Total50Total50 【注】：*如果使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂(Cat#12414~Cat#12415)中配备的Indexprimer进行扩增。 **如果您使用的是Indexedadapter(Cat#12615~Cat#12618)，俗称长接头（大Y接头），可用试剂盒中的PrimerMix进行扩增； 3.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 4.将PCR管置于PCR仪中，设置表17示反应程序，进行PCR扩增。 表17PCR扩增反应程序 温度时间循环数 105℃On热盖 98°C1min1 98°C10sec 10~17cycles*60°C30sec 72°C30sec 72°C5min1 4°CHold-网址：www.yeasen.com第10页，共12页【注】：*文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整，详见注意事项三。 Step6扩增产物磁珠纯化(CleanUpPostAmplification) 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取45μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.9×，Beads:DNA=0.9:1)至AdapterLigation产物中，涡旋或吹打混匀，室温 孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 8.将PCR管从磁力架中取出，加入21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3min），小心移取20μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。 Step7文库质量控制 通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。 附录一：mRNA片段化效果展示 图2.mRNA不同打断时间对应的双链cDNA片段范围。取1μgUniversalHumanReferenceRNA，经mRNA提取试剂盒提取后，分别以94°C，6min、 85°C，8min和85°C，5min处理。打断后mRNA进行双连cDNA的合成，经过1.8×磁珠回收后，通过Agilent2100Bioanalyzer进行检测。 【注】：本结果使用的RNA是Agilent公司的UniversalHumanReferenceRNA，若使用其他来源的RNA，最好优化打断时间。 附录二：FFPE样本建库说明 1.FFPERNA质量评价 rRNA去除建库方案可用于FFPE等低质量的TotalRNA样本，但由于不同FFPE样本的质量差距较大，需要根据样本情况 调整建库条件。常规评价RNA样本质量的参数是RIN值，但是对于FFPE这种降解的样本，并不能完全用RIN值来准 确衡量样本的质量，此时还需要用到DV200指标。DV200表示样本中大于200nt的RNA片段所占的比例，对于降解严重 的FFPE样本，DV200值能够更好的反应样本的质量。 DV200计算方法如下：网址：www.yeasen.com第11页，共12页 1)在一个检测完成的Agilent2100Bioanalyzer结果图中，在Local下选择Advanced 2)勾选SmearAnalysis下的PerformSmearAnalysis选项 3)选择RegionTable页面，鼠标右击，选择AddRegion 4)调整指示线的范围即可得到所选片段范围所占的比例%ofTotal 2.FFPERNA建库示例 下表展示了不同质量FFPE样本在不同建库条件下的文库分布，以供参考。对于降解严重的FFPERNA(DV200<50%)和起始 量低的文库构建，我们推荐接头连接后采用两次纯化方案，以减少文库损失。 RNA样本质控建库条件文库分布质控 RIN=2.2;DV200=74%投入量：1μg 片段化条件：85°C，7min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：14cycles 文库产量：1283ng 投入量：1μg 片段化条件：85°C，7min 接头连接后进行纯化/分选：0.6×； 062×/0.15× 链特异建库扩增：14cycles 文库产量：776ng 投入量：100ng 片段化条件：85°C，7min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：17cycles 文库产量：849ng RIN=2.4;DV200=40%投入量：500ng 片段化条件：85°C，3min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：15cycles 文库产量：308ng 投入量：500ng 片段化条件：85°C，3min 接头连接后进行纯化、分选：0.6×； 0.74×/0.15× 网址：www.yeasen.com第12页，共12页链特异建库扩增：15cycles 文库产量：135ng 投入量：100ng 片段化条件：85°C，3min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：17cycles 文库产量：68ng RIN=2.5;DV200=18%投入量：1μg 片段化条件：85°C，3min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：14cycles 文库产量：264ng RIN=2.5;DV200=19%投入量：100ng 片段化条件：65°C，5min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：17cycles 文库产量：22ng