HieffNGS®C130P1UltimaDNALibraryPrepKitforMGI®是针对MGI®高通量测序平台定向优化而成的新一代建库试剂盒。 作为全新的升级版本，本产品采用高质量的酶学组成，简化的操作流程，可显著提高低质量样本文库转化率与扩增效率，具 有广泛的样本适应性，同时兼容FFPE、cfDNA、ChIPDNA等样本，助力获得优异的测序数据。 适用500pg-1μgDNA样本 兼容cfDNA、FFPE等低质量样本 高效的文库转化率与扩增效率 多样本验证可获得优异的文库与测序数据 严格的批次性能与稳定性质控 产品信息 货号13508ES16/13508ES96 规格16T/96T 组分信息 组分编号组分名称13508ES1613508ES96 13508-AEndprepMix160μL960μL 13508-BLigationEnhancer480μL4×720μL 13508-CFastT4DNALigase80μL480μL 13508-D2×UltimaHFAmplificationMix400μL4×600μL 13508-EPrimerMixforMGI®80μL480μL

-25~-15℃保存，有效期1年。 注意事项 一．关于操作 1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。 3.配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。 4.为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。 5.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。 6.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检 测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂 进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。 7.本产品仅用作科研用途！ 二、关于DNA片段化 1.本试剂盒中兼容机械法及酶切法片段化的DNA。 2.本试剂盒兼容范围为500pg–1μgInputDNA。应尽可能使用A260/A280=1.8-2.0的高质量InputDNA。表1中列举www.yeasen.comPage2of9 了将本试剂盒应用于常见应用中推荐的InputDNA量。 表1常见应用中推荐InputDNA量 应用样本类型推荐InputDNA量 全基因组测序复杂基因组50ng-1μg 靶向捕获测序复杂基因组10ng-1μg 全基因组测序，靶向捕获测序FFPEDNA≥50ng 全基因组测序，靶向捕获测序cfDNA/ctDNA≥500pg 全基因组测序微生物基因组≥1ng 全基因组测序PCR-free测序高质量DNA≥100ng 免疫共沉淀测序ChIP-DNA≥500pg 靶向测序扩增子≥500pg 【注】：上表为使用高质量DNA时推荐的InputDNA量，当InputDNA质量较差或需要进行片段分选时，应适当上调使用量。 3.InputDNA特指投入末端修复/dA尾添加步骤中的DNA。 4.InputDNA制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响末端修复/dA尾添加步骤反应效率，建议DNA 片段化后进行磁珠纯化或分选。当使用机械法进行DNA片段化且产物不进行纯化或长度分选而直接建库时，请将DNA稀释 在TEBuffer中进行片段化，请勿在灭菌超纯水中进行。当使用酶切法进行片段化且产物不进行纯化或长度分选而直接建库 时，请确认StopBuffer中不包含过量的金属离子螯合剂。如条件不满足，可先将片段化产物纯化或长度分选后溶于TEbuffer 或灭菌超纯水中（≤50μL），再进行文库构建。 三、关于接头连接 1.目前华大智造有2种序号的接头：1-128和501-596。关于其使用要求，请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明 或咨询本公司。此外，华大智造申明：2种接头由于设计工艺不同，禁止混用，否则测序数据无法拆分！ 2.Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。请按照表2和实际DNA投入量确实确定接头用量，需要稀释 接头时，请用TEbuffer对接头进行稀释。 表2500pg-1μgInputDNA推荐的Adapter使用量 InputDNA10μMAdapter稀释倍数稀释后投入量（μL） 31ng-1μg不稀释5 11-30ng55 3-10ng105 0.5-2ng205 四、DNA磁珠纯化与分选（Bead-basedCleanUpandSizeSelection） 1.DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。 2.当InputDNA质量≥50ng，您可选择在接头连接后分选；如InputDNA质量<50ng，建议您在文库扩增后进行分选。 3.LigationEnhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮磁珠分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须 先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分 选步骤。 4.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。 5.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。 6.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。www.yeasen.comPage3of9 7.磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。 8.进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。 9.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而 降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5min足以让磁珠充分干燥。 10.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱，产物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1个月。 五、关于文库扩增（LibraryAmplification） 1.是否需要进行文库扩增取决于InputDNA量、应用需要等因素。当InputDNA<200ng时，推荐进行文库扩增；当Input DNA≥200ng或者不需要进行文库扩增时，可不进行文库扩增。 2.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重 复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表3列举了本试剂盒，获得100ng或1000ng文库的所需循环 数。 表3500pg-1μgInputDNA获得100ng或1000ng产物扩增循环数推荐表 InputDNA(IntoEndPreparation)Numberofcyclesrequiredtogenerate1μg 100ng1000ng 1μg03-4 500ng04-5 250ng1-45-7 100ng2-56-8 50ng4-78-10 10ng6-89-12 5ng7-1011-14 1ng9-1112-15 500ng11-1314-16 【注】：建库过程中进行过长度分选时参照较高循环数扩增。 六、关于文库质检（LibraryQualityAnalysis） 1.通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。 2.文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。 3.文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。 4.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区 分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增 原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库 的干扰。 5.文库长度分布检测，可通过AgilentBioanalyzer2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。www.yeasen.comPage4of9 使用说明 一、自备材料 1.纯化磁珠：Cat#12601，HieffNGS®DNASelectionBeads或Cat#A63880，AMPureXPBeads或其他等效产品。 2.DNA质控：AgilentTechnologies2100Bioanalyzer或其他等效产品。 3.DNAAdapter：详情请咨询华大智造或本公司。 4.其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TEBuffer（10mMTris-HCl，pH8.0-8.5+0.1mMEDTA）、低吸附EP管、PCR管、 磁力架、PCR仪等。 二、操作流程 图1UltimaDNA建库试剂盒操作流程 三、操作步骤 3.1末端修复/dA尾添加（EndPreparation/dA-Tailing） 该步骤将InputDNA末端补平，并进行5’端磷酸化和3’端加dA尾。 1.将表4中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。 2.于无菌PCR管中配制表4所示反应体系。 表4末端修复/dA尾添加PCR反应体系 名称体积（μL） FragmentedDNAx EndprepMix10 ddH2OUpto60 3.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。 4.将上述PCR管置于PCR仪，设置表5所示反应程序，进行末端修复/dA尾添加反应。www.yeasen.comPage5of9 表5末端修复/dA尾添加PCR反应程序 温度时间 热盖105°COn 30°C20min 72°C20min 4°CHold 3.2接头连接(AdapterLigation) 该步骤将3.1步骤的产物末端，连接特定的MGI®接头。 1.根据InputDNA量按表2稀释Adapter至合适浓度。 2.将表6中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 3.于3.1步骤PCR管中配制表6所示反应体系。 表6AdapterLigation体系 名称体积(μL) dA-tailedDNA（3.1步骤产物）60 LigationEnhancer30* FastT4DNALigase5 DNAAdapter5 【注】：*LigationEnhancer比较粘稠，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。 4.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 5.将PCR管置于PCR仪中，设置表7所示反应程序，进行接头连接反应： 表7AdapterLigationPCR反应程序 温度时间 热盖Off 20°C15min 4°CHold 【注】：当InputDNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。 3.3连接产物磁珠纯化(PostLigationCleanUp) 该步骤使用磁珠对接头连接产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或AdapterDimer等无效产物。 3.3.1纯化操作步骤： 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取60μLHieffNGS®DNASelectionBeads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至AdapterLigation产物中，涡旋混匀或移 液器吹打10次混匀，室温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 8.将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱： 1）如产物无需进行片段分选，直接加入21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。www.yeasen.comPage6of9 【注：如纯化产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min）， 小心移取20μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。 2）如产物需进行双轮分选，加入102μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。【注： 如纯化产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min），小 心移取100μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。 3.3.2双轮分选操作步骤： 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡约30min。配制80%乙醇。 2.请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。 3.根据DNA片段长度要求，参考表8向上述100μLDNA上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀 表8磁珠文库分选推荐比例 DNA文库插入片段大小150-250bp200-300bp300-400bp DNA文库大小230-330bp280-380bp380-480bp 第一轮体积比（Beads:DNA）0.78×0.68×0.58× 第二轮体积比（Beads:DNA）0.20×0.20×0.20× 【注】：表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为200bp，样品DNA体积为100μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.78×100μ L=78μL；第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100μL=20μL；表中所推荐比例是针对于AdapterLigatedInsertDNA（PostLigation），如果用户 在接头连接前进行分选，请采用HieffNGS®DNASelectionBeads（Cat#12601）说明书中推荐的比例。 4.室温孵育5min。 5.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心转移上清到干净的离心管中。 6.参考表8向上清中加入第二轮分选磁珠。 7.涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5min。 8.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 9.保持PCR管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。 10.重复步骤9。 11.保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5min）。 12.将PCR管从磁力架中取出，加入适量21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5min。 13.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5min），小心转移20μL上清至干净的管中。 3.4文库扩增(LibraryAmplification) 该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。 1.将表9中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 2.于无菌PCR管中配制表9所示反应体系。 表9PCR扩增反应体系 3.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 4.将PCR管置于PCR仪中，设置表10所示反应程序，进行PCR扩增。名称体积(μL) 2×UltimaHFAmplificationMix25 PrimerMixforMGI®5 AdapterLigatedDNA（3.3步骤产物）20www.yeasen.comPage7of9 表10PCR扩增反应程序 温度时间循环数 98°C1min1 98°C10sec 参照注意事项中表360°C30sec 72°C30sec 72°C5min1 4°CHold- 3.5扩增产物磁珠纯化或分选(PostAmplificationCleanUp/SizeSelection) 同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用HieffNGS®DNASelectionBeads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）纯化文库扩增产物。 如需分选，操作方法同3.3.2双轮分选步骤（纯化步骤可省略）。 3.6文库质量控制 通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价。 3.7文库环化 使用HieffNGS®Fast-PaceDNACyclizationKitforMGI®（Cat#13341）或其他等效产品进行文库单链环化反应。 3.8参考实例 使用HieffNGS®C130P1UltimaDNALibraryPrepKitforMGI®对50ngE.coli超声样本建库，结果使用Agilent Bioanalyzer2100进行检测。 图2UltimaDNA建库试剂盒样本及PCR纯化产物（分选前后）Agilent2100检测结果 www.yeasen.comPage8of9 备忘录： ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————————www.yeasen.comPage9of9 备忘录： ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————帮助客户创造价值，让世界更健康更快乐