HieffNGS®MaxUpIIDual-modelmRNALibraryPrepKitforIllumina®是针对Illumina®高通量测序平台专门研发的用于 mRNA转录组文库构建试剂盒，本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并，极大地缩减建库时间。二链 合成模块配有两种buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为0.1-4μg不同来源真核 生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品 最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。 试剂盒包含两个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转 录试剂，常规和链特异性dscDNA合成，以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP， 使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提 供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。 产品组分 组分编号和名称12300ES0812300ES2412300ES96 BOX-I12603-AmRNACaptureBeads0.4mL1.2mL4.8mL 12603-BBeadsBindingBuffer0.4mL1.2mL4.8mL 12603-CBeadsWashBuffer5mL15mL60mL 12603-DTrisBuffer0.4mL1.2mL4.8mL BOX-II12251-AFrag/PrimeBuffer150μL450μL2×900μL 12251-B1stStrandEnzymeMix16μL48μL192μL 12251-CStrandSpecificityReagent50μL150μL580μL 12251-D2ndStrandBuffer(dNTP)240μL720μL2×1440μL 12251-E2ndStrandBuffer(dUTP)240μL720μL2×1440μL 12251-F2ndStrandEnzymeMasterMix40μL120μL480μL 12251-GLigationEnhancer240μL720μL2×1440μL 12251-HQuickT4DNALigase40μL120μL480μL 12251-I2×SuperCanace®IIHigh-FidelityMix200μL600μL2×1200μL 12251-JPrimerMix40μL120μL480μL

冰袋运输。效期一年。存储温度如下，切不可搞错！ BoxI：2-8℃保存；BoxII：-20℃保存。 注意事项 一、关于操作 1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。 3.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline：400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第2页，共8页4.请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap高效核酸去除喷雾去除 RNA酶污染。 5.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测 区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的 DNAZap高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。 6.本产品仅用作科研用途！ 二、应用范围 本试剂盒适用于起始模板量为0.1-4μg（体积≤50μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度 偏低，体积超过50μL，可使用HieffNGS®RNACleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent2100BioanalyzerRNA6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。 本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo(dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA， 如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A) 尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。 本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括： 基因表达（geneexpression） 单核苷酸变异检测（singlenucleotidevariationdiscovery） 基因融合鉴定（genefusionidentification） 剪切变异体分析（splicevariantanalysis） 三、关于接头连接（AdapterLigation） 1.本公司可提供长接头（barcodedAdapter）试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需 求进行选择。 目前有48种IndexedAdapters:HieffNGS®CompleteAdapterKitforIllumina®,Set1~Set4（Cat#12615~Cat#12618）；单端96 种IndexPrimers:HieffNGS®96SingleIndexPrimersKitforIllumina®,Set1~Set2（Cat#12611~Cat#12612）；双端384种 IndexPrimers:HieffNGS®RNA384CDIPrimerforIllumina®Set1~Set2（Cat#12414~Cat#12415）。 2.我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的 防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。 3.使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。 4.建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5μL，请根 据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TEbuffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。 表1InputTotalRNA量与接头浓度推荐表 InputTotalRNAAdapterstockconcentration 100ng1.5μM 500ng3μM ≥1μg5μM 四、关于磁珠纯化与分选（Bead-basedCleanUpandSizeSelection） 1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用HieffNGS®DNASelectionBeads(YeasenCat#12601)或 AMPure®XP磁珠(BeckmanCat#A63880)进行DNA纯化和分选。 2.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。 3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。 4.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline：400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第3页，共8页5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。 6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降 低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5min足以让磁珠充分干燥。 7.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TEBuffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。 五、关于文库扩增（LibraryAmplification） 1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性， 即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。 2.如果您使用IndexedAdapter（也称为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物Primermix进行扩增；如果使用的 是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用indexprimers进行扩增，加上相应的barcodes。 3.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复 度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，InputTotalRNA量与相应 扩增循环数的推荐。 表2InputTotalRNA量与扩增循环数推荐表* InputTotalRNANumberofcycles Non-strandedStranded 100ng12-1414-16 1000ng10-1212-14 ≥2000ng8-1010-12 【注】：*由于不同物种和组织所提取的TotalRNA中，mRNA的含量差异较大。实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增 循环数。 六、关于文库质检（LibraryQualityAnalysis） 1.通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。 2.文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。 3.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接 Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样 品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。 4.文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。 5.文库长度分布检测，可通过AgilentBioanalyzer2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。 使用方法 一、自备材料 1.纯化磁珠：HieffNGS®DNASelectionBeads（Cat#12601）或AMPureXPBeads（Cat#A63880）或其他等效产品。 2.RNA质控：Agilent2100BioanalyzerRNA6000Nano/PicoChip或其他等效产品。 3.Adapters：barcodedadapter（长接头）或者无barcode的短接头试剂盒。 4.文库质检：Agilent2100BioanalyzerDNA1000Chip/HighSensitivityChip或其他等效产品；文库定量试剂。 5.其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline：400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第4页，共8页二、操作流程 图1mRNA建库试剂盒操作流程 三、操作步骤 3.1mRNA纯化和片段化（mRNAPurificationandFragmentation） 1.将mRNACaptureBeads从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温，约30min。 2.准备一个Nucleasefree离心管，取0.1-4μg总RNA，用Nucleasefree水将体积补至50μL，冰上放置备用。 3.颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50μL磁珠悬液加入至50μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。 4.将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65℃，5min；4℃，hold，使得RNA变性。 5.室温孵育5min，使mRNA与磁珠完全结合。 6.将样品置于磁力架中，室温静置5min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。 7.将样品从磁力架上取出，用200μLBeadsWashBuffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中， 室温静置5min，小心移除上清。 8.重复步骤7，共洗涤两次。 9.将样品从磁力架上取出，加入50μLTrisBuffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。 10.将样品置于PCR仪中，80℃，2min；25℃，hold，将mRNA洗脱下来。 11.将样品从PCR仪中取出，加入50μLBeadsBindingBuffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。 12.室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。 13.将样品置于磁力架中，室温静置5min，小心移除上清。 14.将样品从磁力架上取出，用200μLBeadsWashBuffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回 至磁力架中，室温静置5min，吸掉全部上清。 【注】：最后需要用10μL移液器吸干净残留液体。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline：400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第5页，共8页15.将样品从磁力架上取出，用18.5μLFrag/Primebuffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中（预 设为94℃或85℃），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段 化时间的梯度，比如94℃，5min或85℃，6min。使用Agilent2100分析双链cDNA纯化产物大小。 表3mRNA片段化程序选择 插入片段大小（bp）打断程序 150-20094°C，6min； 200-30094°C，5min； 250-45085°C，8min； 400-55085°C，6min； 16.片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17μL上清 至一个新的nucleasefree离心管中，立刻进入第一链合成反应。 3.2第一链cDNA的合成： 1.将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表4所示，配制第一链cDNA合成的反应液。 表4第一链cDNA合成反应体系 名称体积（μL） FragmentedmRNA17 StrandSpecificityReagent6 1stStrandEnzymeMix2 2.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。 3.将上述PCR管置于PCR仪中，按照表5所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA 的合成。 表5第一链cDNA合成反应程序 温度时间 热盖105°COn 25°C10min 42°C15min 70°C15min 4°CHold 3.3第二链cDNA的合成/末端修复/加A： 1.将第二链合成试剂从-20°C取出，解冻后颠倒混匀；按照表6所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。 表6第二链cDNA合成反应体系 名称体积（μL） 1stStrandcDNA25μL 2ndStrandBuffer(dNTPordUTP)*30μL 2ndStrandEnzymeMasterMix5μL 【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的buffer。 2.使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。 3.将上述PCR管置于PCR仪中，按照表7所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline：400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第6页，共8页表7第二链cDNA合成反应程序 温度时间 热盖105°Con 16°C30min 72°C15min 4°CHold 3.4接头连接（AdapterLigation） 该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina®接头。 1.参考注意事项三中的表1，根据InputRNA量，稀释Adapter至合适浓度。 2.将表8中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 3.于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表8所示反应体系。 表8AdapterLigation体系 名称体积（μL） dA-tailedDNA60 LigationEnhancer30* QuickT4DNALigase5 DNAAdapter5** 【注】：*LigationEnhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。 **本公司接头原始浓度为15μM,请根据注意事项三表1的提示，用0.1×TEbuffer对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5μL。 4.使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 5.将PCR管置于PCR仪中，设置表9所示反应程序，进行接头连接反应： 表9AdapterLigation反应程序 温度时间 热盖Off 20°C15min 4°CHold 【注】：当InputDNA量较低时，可尝试将连接时间延长一倍，这将提高连接效率。 3.5连接产物纯化和片段大小分选（PostLigationCleanUpandSizeSelection） 目前有两个方案应用于该步骤，当插入片段＜200bp时，使用方案A；当插入片段≥200bp时，使用方案B。 方案A：适用于插入片段150-200bp的文库（如mRNA打断方案为94°C，6min） 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取60μLHieffNGS®DNASelectionBeads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至AdapterLigation产物中，涡旋或吹打混匀，室 温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 8.将PCR管从磁力架中取出，加入21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min），小心移取20μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline：400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第7页，共8页方案B：适用于插入片段大于200bp的文库（如mRNA打断方案为94°C，5min或85℃，8min） 方案B-1：接头连接产物的纯化 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取60μLHieffNGS®DNASelectionBeads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至AdapterLigation产物中，涡旋或吹打混匀，室 温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 8.将PCR管从磁力架中取出，加入102μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min），小心移取100μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。 【注】：LigationEnhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响，所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。 方案B-2：双轮分选 1.请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。 2.根据DNA片段长度要求，参考表10，在上述100μLDNA中加入第一轮分选磁珠，涡旋或移液器吹打10次混匀。 表10文库分选推荐磁珠比例 DNA文库插入片段大小（峰值，bp）~200~300~400~500 打断条件94℃，5min85℃，8min85℃，8min85℃，6min 短接头连接之后分选第一轮体积比0.80×0.65×0.60×0.54× 第二轮体积比0.20×0.15×0.15×0.10× 长接头连接之后分选或文库 扩增之后分选第一轮体积比0.74×0.62×0.56×0.52× 第二轮体积比0.15×0.15×0.15×0.10× 【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure®XP磁珠和HieffNGS®DNASelectionBeads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段 主峰为300bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100μL=65μL，第二轮分选磁珠使用体 积为0.15×100μL=15μL；若在长接头连接之后分选，样品DNA体积为100μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.62×100μL=62μL，第二轮分选磁珠 使用体积为0.15×100μL=15μL。 3.室温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2μL溶液于 管底。 5.参考表10向上清中加入第二轮分选磁珠。 6.涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5min。 7.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 8.保持PCR管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。 9.重复步骤8。 10.保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5min）。 11.将PCR管从磁力架中取出，加入21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5min。 12.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5min），小心转移20μL上清至干净管中。 3.6文库扩增（LibraryAmplification） 该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。 1.将表11中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 2.于无菌PCR管中配制表11所示反应体系。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline：400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第8页，共8页表11-A短接头连接产物PCR反应体系表11-B长接头连接产物PCR反应体系 组分名称体积（μL） 2×SuperCanace®IIHigh-FidelityMix25 UniversalPrimer/i5Primer*2.5 IndexPrimer/i7Primer*2.5 AdapterLigatedDNA20 【注】：*如果使用的是无barcode的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂中配备的indexprimer进行扩增（Cat#12611，HieffNGS® 96SingleIndexPrimersKitforIllumina®,Set1;Cat#12612,HieffNGS®96SingleIndexPrimersKitforIllumina®,Set2。Cat#12414,HieffNGS®RNA384 CDIPrimerforIllumina®,Set1;Cat#12415,HieffNGS®RNA384CDIPrimerforIllumina®,Set2。） **如果您使用的是barcodedadapter，俗称长接头（大Y接头），即adapter上带有barcode的完整接头，可用试剂盒中的PrimerMix进行扩增； 3.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 4.将PCR管置于PCR仪中，设置表12示反应程序，进行PCR扩增。 表12PCR扩增反应程序 温度时间循环数 98°C1min1 98°C10sec 参照表2（注意事项五）60°C30sec 72°C30sec 72°C5min1 4°CHold- 3.7扩增产物磁珠纯化或分选（PostAmplificationCleanUp/SizeSelection） 同3.5步骤中纯化操作步骤。使用HieffNGS®DNASelectionBeads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）纯化文库扩增产物。 3.8文库质量控制 通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。 附录一：mRNA片段化 图2.mRNA不同打断时间对应的双链cDNA片段范围。取1μgUniversalHumanReferenceRNA，经mRNA提取试剂盒提取后，分别以94°C，6min、 85℃，8min和85℃，5min处理。打断后mRNA进行双连cDNA的合成，经过1.8×磁珠回收后，通过Agilent2100Bioanalyzer进行检测。 【注】：本结果使用的RNA是Agilent公司的UniversalHumanReferenceRNA，若使用其他来源的RNA，最好优化打断时间。组分名称体积（μL） 2×SuperCanace®IIHigh-FidelityMix25 Primermix**5 AdapterLigatedDNA20